Entre 1864 e 1870, o Pantanal abrigou um dos principais conflitos da América do Sul: a Guerra do Paraguai. De um lado, a Tríplice Aliança, formada por Uruguai, Argentina e Brasil, além do apoio da Inglaterra. Do outro, o Paraguai, liderado por Solano Lopez.

Seus soldados invadiram o Mato Grosso e conquistaram várias cidades como Corumbá e Cáceres, provocando o êxodo dos fazendeiros e da população urbana para Cuiabá.

Mesmo assim o poderio da Tríplice Aliança foi vitorioso, mas pouco sobrou das cidades e fazendas pantaneiras. O gado sobrevivente tornou-se disperso e selvagem.

Terminada a guerra, os antigos povoadores retornavam de Cuiabá. Houve um grande afluxo de capital estrangeiro, a redivisão das grandes propriedades rurais e a reabertura da navegação fluvial do rio Paraguai até o estuário do Prata, entre Buenos Aires (Argentina) e Montevidéu (Uruguai).

Com a derrota do Paraguai, o Brasil ampliou seu território na região, incorporando cerca de 47.000km² de terras pertencentes ao Paraguai. Parte dessa área conquistada integra o Pantanal mato-grossense.